藻红蛋白标记抗体技术

(1) 藻红蛋白(Phycoertyhrin PE)标记抗体法

      a、巯基化PE的制备

600μl的15.5mg/ml氯化 硫醇亚胺(Iminothiolane hydrochloride,sigma)加到1.2ml的3.6mg/ml的PE，在125mMPH6.8的磷酸钠中，室温90分钟后，对50mMPH6.8 P.B.4℃透析然后换PH7.5PB透析。每个PE分子中可结合8个巯基。

      b、PE-IgG的制备

30ul的1.1mg/mlSPDP(N-Succinimdy1 3-(2-pyridyldithio) propinate)(SPDP为异双功能试剂,分子式为

      国产的乙醇溶液，加入700μl，4.2mg/ml IgG的50mMPH7.5 P.B.溶液,室温反应2.5小时。(SPDP对IgG的克分子比率为5.3),取400μl的1.7mg/ml的巯化PE同上缓冲液，加到500μl反应混合液中，室温反应12小时，加入100μl的50mM碘乙酸钠封闭残余巯基，对PB，4℃透析过夜。

(2) 藻红蛋白标记蛋白A

    0.5mi PE(4.08mg/ml)的0.M PH7.4PB，含有0.1MNaCl，10μ1 SPDP无水甲醇液(2.65mg/ml)，SPDP/蛋白克分子比为10，22℃反应5分钟，过SephadexG-50,(1x17cm)，用100mM PH7.4PB含有0.1M NaCI平衡柱子，并洗下PE蛋白峰。

    0.5ml蛋白A，2mg/ml的100mMPB含有100mM NaC1PH7.4，2.6ul上述SPDP甲醇液，SPDP:蛋白液=9.5， 22℃40分钟，加入25ul1M二硫苏糖醇(DTT)在PH7.4缓冲液中，22℃，25分钟，同上过SephadexG-25柱，收集蛋白A峰。

    活化PE:硫醇化蛋白A的克分子 比为1∶2， 取0.77mg/ml的PE，和0.27mg/ml蛋白 A，22℃，反应6小时，混合物4℃保存备用。

    以上两种PE标记制品，可最后配于0.01M PH7.4PB，含有0.1M EDTA、1mM碘乙酰胺、1%BSA和0.1%NaN₃ ，0-5℃保存。

    附藻红蛋白的制备

取新鲜红藻(red algate)用蒸馏水洗净，悬50mMPH7.0PB中，组织匀浆器打3分钟，几层纱布过滤，离心去除小颗粒，上清液用60%饱和硫酸铵盐析，以上操 作4℃下进行，离心收集沉淀，重悬于60%(NH₄)₂SO₄于50mM PH7.0PB，过DEAE-纤维素层析，用降低硫酸铵饱和度的PB溶液洗柱子，PE洗脱于

10%(NH₄)₂SO₄和200mM PH7.0 PB液中，经硫酸铵盐析浓缩，重溶于50mM PH7.0PB，加入(NH₄)₂SO₄在10%饱和度，4℃可结晶出来。

文献:Vernon T、et al;J、Cell Biology 93,1982,P981-6.