时间分辨荧光免疫分析原理

    1979年Wieder 等首先建立了稀土螯合物标记抗体的时间分辨荧光免疫分析(Time- resolved fluor-immumoassay，TR-FIA)。TR-FIA 是一种利用荧光发射体荧光寿命差别而将波长相同的荧光分开的近代荧光光谱技术。

    来自组织或血清中各种蛋白荧光和其它化合物的非特异荧光的寿命一般在1-10ns,最长也不超过20ns。像人血清白蛋白的荧光寿命为4.1ns,球蛋白的荧光寿命为3.0ns,FI- TC的荧光寿命为4.5ns,而稀土螯合物一般具有相当长的荧光寿命(10us-1ms)比 背景荧光长3-4个量级。所以利用此原理IR-FIA 很容易将稀土螯合物的荧光与背景荧光区别开来。

      稀土螯合物的标记方法

目前用于TR-FIA的稀土离子(镧系离子)有铕(Eu，分子量152)，铽(Tb，分子量158.9)，钐(Sm分子量150.4)和钕(Nd，分子量144.2)。利用双功能螯合剂1-(对一苯偶氮)-EDTA，异 硫 氰 酸苯基-EDTA，异硫氰酸苯甲基-DTTA和二乙三 胺五乙酸(DTPA)等可将稀土离子和抗体或抗原分子上的氨基联接起来。此法可允 许 每个蛋白质分子上标记50个Eu离子不影响其生物活性和稳定性。

异硫氰酸苯基-EDTA-Eu与蛋白质的连接如下：

    用DTPA标记抗体的方法为:取纯化厉抗体IgG“10mg/ml的溶液200u，加到1mg- DTPA酸酐中,PH调到7.0,旋转混合1分钟。再室温反应5分钟,连续两次对柠檬酸缓冲液透析，继之间已联接DTPT的抗体中加入100μl33mM/升EuCl溶液室温反应30分钟，并缓缓搅动。再进一步通过SephadexG-50柱去除游离EuC1分子。

      文献：

    徐永源，上海免疫学杂志、1989、9(4),211-215页。 Soini方法:

    取荧光铕螯合剂-W1014,用PH9.8磷酸盐缓冲液将W1014配成相当200倍克分子IgG的量，20℃保温过夜，过Sephadex G-50去除游销离子。

      文献：

Erkkjsoini,et al;Jof histochemistry and cytochemisthy 36(11),PP14491451,1988。