双向免疫扩散

【基本原理】

      双向免疫扩散实验包括试管法和平板法，较常用的是平板法。该法是由 Ouchterlony（1948年）首先建立。故又称Ouchterlony法。它的基本原理是抗原（可溶性）和抗体在琼脂糖凝胶介质中，有一定PH和盐离子存在下，两者相向扩散，至相对应性抗原与抗体适合比例时，则可出现免疫沉淀线，根据沉淀线的种类及特点，从而去鉴别抗原或抗体的性质异同。

【方    法】

      1、配制1%的PH8.6,   0.05μ巴比妥离子琼脂糖凝胶，沸水融化后分装待用，如暂时不用可加入 0.01%NaN3分装适量放4℃存放。

      2、倒板，根据需要倒置适当大小的琼脂糖凝胶板。常用的是将2.5~4ml凝胶（温度降至50-55℃）倒于平放的普通载玻片制成（7.5×2.5cm）。室温放置15分钟，再放4℃ 10分钟后使用，所制好胶板如不当时用，可放平皿或其它密封湿容器中不长菌。

      3、打孔，根据实验要求可打成各种孔大小的不同图形。常用的是孔径3 mm的梅花图形。不同打孔图形要求见图42。

       4、加样扩散，如测抗体效价，应对倍稀释后分别加到梅花孔四周，抗原加在中心孔，且抗原如Ig**在100ug/ml浓度，或全血清稀释100倍作抗原。如检查抗原性质或纯度,可以上述浓度加到中心孔,四周分别加入不同种类抗血清。加样量3mm 孔约10pl,5mm孔约15ul。加样后湿室37℃扩散IgG5-12小时，IgA24小时以上，IgM要24-48小时方可扩散充分。

      5、结果分析与保存，双向扩散出现沉淀线的位置及形状进行分析，主要有三种结果形式，即抗原性相同、不同或部分相同，相应沉淀线为融合、交叉，见图43。对于双向扩散沉淀线保存，其操作同免疫电泳的部分内容。

    a相同抗原沉淀线融合，b相同抗原沉淀线融合，但两抗原浓度不同，e两抗原性完全不同，产 生交叉性沉淀线，d抗原部分相同，e两者互相都部分相同抗原。